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技術(shù)文章

光遺傳系統(tǒng)的試驗操作方法分享

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  光遺傳系統(tǒng)利用分子生物學、病毒生物學等手段,將外源光敏感蛋白基因?qū)牖罴毎?,在細胞膜結(jié)構(gòu)上表達了光敏感通道蛋白;然后通過特定波長光的照射,控制細胞膜結(jié)構(gòu)上的光敏感通道蛋白的激活與關(guān)閉;光敏感蛋白的激活和關(guān)閉可控制細胞膜上離子通道的打開與關(guān)閉,進而改變細胞膜電壓的變化,如膜的去極化與超極化。
 
  光遺傳系統(tǒng)技術(shù)通過一定波長的光對細胞進行選擇性地興奮或者抑制,達到控制特定類型細胞活動的目的。光遺傳學技術(shù)對細胞的選擇性目前主要通過三種方法實現(xiàn):
 
  通過病毒載體直接選擇性表達光感基因。相比轉(zhuǎn)基因動物,病毒載體具有很多優(yōu)勢,包括:制備周期短,從載體克隆到病毒表達只需要數(shù)周時間就可以完成;可用于難以轉(zhuǎn)基因的動物,如靈長類等;病毒表達只局限于注射位點,如某個特定的腦區(qū),因此具有空間選擇性;某些病毒具有天然嗜性,只感染一些特定的細胞類型等。目前廣泛用于光遺傳學研究的病毒載體是慢病毒和腺相關(guān)病毒載體。
 
  病毒注射常見問題解析:
 
  病毒保存:病毒-80分裝儲存,避免反復凍融,4度保存建議不超過一周。使用過程中病毒置于冰上或放在4度冰箱,盡量減少在室溫的放置時間。
 
  病毒稀釋:無菌PBS或生理鹽水稀釋均可,稀釋后盡量一次用完。
 
  病毒注射針尖堵住的處理方法:首先使用生理鹽水棉球擦拭針尖,注射泵快推后針尖仍堵住則要剪掉部分電極。
 
  確定注射到腦組織:觀察玻璃電極內(nèi)病毒與液體石蠟接觸液面分層是否下降。
 
  病毒較多漏到目標腦區(qū)上方核團的原因:注射完停針時間不夠,原則上不少于10min;注射速度較快,建議注射速度選擇10-30nl/min,注射時間控制在10min為宜。
 
  根據(jù)目標核團、病毒滴度、病毒種類和功能元件大小確定注射量。
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